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      親和填料制備操作步驟

      發布時間:2019-07-12 14:51:37 | 來源:

      1. 將25mL的氨基-瓊脂糖珠轉移到50mL潔凈的空柱子,用500mL蒸餾水漂洗。

      2. 用50mL 50%的冷丙酮洗1次,溶液即將完全進入膠層時,加入50mL 75%的冷丙酮洗1次,溶液即將完全進入膠層時,再加入100mL 100%冷丙酮洗1次。

      3. 溶液即將完全進入膠層時,加入含有1mL三乙胺的50mL 丙酮溶液,當溶液(還剩)1/3在膠層上時,反復震蕩重懸瓊脂糖珠。

      4. 用2mL DMF(富馬酸二甲脂)溶解150mg NHS活化的碘乙酸,徹底溶解后,1000轉離心1分鐘,取上清邊振蕩邊逐滴加入3重懸好的瓊脂糖珠,蓋緊,室溫避光反應45分鐘。

      5. 流干瓊脂糖珠液體,用100mL 100%丙酮洗1次,溶液即將完全進入膠層時,用含有0.1N HCL的50mL 75%的冷丙酮洗1次,溶液即將完全進入膠層時,用含有0.1N HCL的50mL 50%的冷丙酮洗1次。

      6. 流干瓊脂糖珠液體,用500 mL蒸餾水洗1次。

      7. 將瓊脂糖珠分成5份,5mL/(份)管,排盡水分,可用于5個多肽抗原的偶聯。

      8. 用1mL含有10mM EDTA的0.1 M Na2CO3溶液溶解5mg抗原多肽,加入“7”準備好的活化瓊脂糖珠,用2mL蒸餾水洗多肽瓶,洗液轉到活化瓊脂糖珠。振蕩重懸瓊脂糖珠,室溫中速搖床上反應60分鐘。

      9. 流干瓊脂糖珠液體,回收液體(含有游離的抗原,可以用于ELISA抑制時用)。

      10. 按照新填料的使用步驟進行抗體純化實驗。 11.用ELISA法檢測比較抗體純化前后的效價變化情況,判斷填料提純效果。 注意:第8步要先配現用,盡量避光,防止多肽上的巰基氧化(-SH? -S-S- )

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