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      免疫印跡實驗步驟

      發布時間:2019-07-12 14:48:30 | 來源:

      一 SDS-PAGE電泳(跑膠:蛋白質分離)

      1 制膠:

      按配方配制凝膠。根據分子量大小選擇合適濃度的分離膠:5-7%的分離膠可轉移29-150kda, 8-10%用于小于14-66kda,18-20%用于小于20kDa的SDS變性蛋白質,轉移效率約100%。

      灌分離膠:

      兩塊板約需15mL。裝好凝膠灌膠裝置,加入蒸餾水放置5分鐘,檢查是否漏水。不漏,倒去水,滴干,開始灌膠。

      戴上手套(因聚丙烯酰胺Acrylamide,過硫酸銨,TEMED試劑有毒),按組分別在燒杯中加入各種試劑(上述三種存于冰箱,TEMED為促凝劑),用注射器(加樣器)混勻,然后將分離膠液體從頂部沿側邊注入,液面超過中間分隔板些許,加完雙面后左右晃動一下,使液面平整。在沿邊壁輕放入90%異丙醇,讓凝膠靜置30min以上。倒去90%異丙醇,用雙蒸餾水洗滌2-3次,剪下小濾紙吸干夾層中的水,再灌濃縮膠。

      通常不能形成整齊凝膠的原因是過硫酸銨或TEMED有問題或兩者都有問題。

      灌濃縮膠:

      兩塊板約需5mL,按組分在燒杯中加入各種試劑(上述三種存于冰箱,TEMED為促凝劑),用注射器(加樣器)混勻,然后將濃縮膠液體從頂部沿側邊注入,液面幾乎充滿夾層,插入梳子膠全部充滿夾層,室溫靜置40min以上。

      保薦備用:用保鮮膜將整個裝置密封,置冰箱4℃保存,可在一周內使用。

      2 加電極液及加樣:

      選取合適濃度的已灌膠(上層為積層膠即濃縮膠,下層為分離膠)的電泳裝置,取下玻璃平板夾層,小心拔出teflon梳子,避免撕裂聚丙烯酰胺凝膠加樣孔(碰歪可用最小bir頭或針拔正)。重新放入電泳槽內(注意:玻璃夾板凹面向里,灌膠時向外),先往加樣槽內加滿1×SDS電極緩沖液,然后小心往加樣孔加樣,加樣量見免疫印跡試驗記錄表,加完樣后,在電泳裝置內槽加入1×SDS電極緩沖液,使液面高于夾板凹面接近最高面,并且外槽也要加電極液(上次的內槽電極液:重復利用)。

      3 電泳:

      加完樣(加樣量以每孔30-50μg為準)后裝上電極(裝置外用冰袋降溫)開始電泳(蛋白質分離):先設定80v電壓電泳,當指示劑(溴酚藍)泳動到分離膠界面(蛋白質通過濃縮膠層)時約40min,待指示劑(溴酚藍)接近分離膠底時(約需2h)電泳結束。

      電泳為恒壓電泳。

      二 膜轉移(半干轉移):

      1 切膠:

      戴上乳膠手套(進行接觸濾紙,凝膠和膜的操作時,應戴手套,因為手上的油脂會阻斷轉?。?,取下電泳玻璃夾板,小心分開夾板,把濃縮膠用分離膠多余部分切除,按膠的尺寸大小再剪取硝酸纖維素膜(NC膜)二張用八張濾紙(可先剪好)

      2 泡膠: 將上述切好的凝膠塊,NC膜,濾紙在半干電轉緩沖液中浸泡15分鐘。

      3 裝槽: 在半干轉移的支持墊上按雙層濾紙→分離膠→NC膜→雙層濾紙的順序疊放,用濕玻棒輕輕滾過,排盡氣泡(各層之間不能有氣泡),凝膠靠近負極,而NC膜靠近正極。

      4 半干轉移:

      蓋上半干轉移槽蓋,夾緊,插上電極電源,設定電流100mA,轉移約35min, (分子量越大,時間越久,也可150mA,30min,大分子量,電流調大轉移快些,小分子量,電流調大,易轉移過頭)。整個轉移槽組合順序為:負極→支持墊→濾紙→分離膠→NC膜→濾紙→支持墊→正極。

      5 洗膜:

      轉移完畢,先用蒸餾水沖洗,再將NC膜放放已盛有TBST(TBS+0.05%的吐溫)的培養皿中在搖床約4min。

      6 做好標記:

      根據多肽分子量標準混合物溶液(混MK)在NC膜上顯示的藍色帶在膜上壓出壓痕—即混合M的分子量的標線:96kd,70kd,45kd,32kd,18kd。

      7 封閉:

      在培養皿中加入適量體積10-15mL的含5%的脫脂奶粉的TBST(或含3%BSA,或用TBST與豬血清1:1溶液),放入NC膜,室溫下搖動封閉30分鐘以上,用膠膜蓋好培養皿,置膠膜蓋好培養皿,置冰箱中過夜(主要是接著做時間不夠)。

      8 上一抗:

      將NC膜TBST洗滌搖洗3次,每次5分鐘。

      取培養皿10個,編號:11#,12#,13#,14#,15#,21#,22#,23#,24#,25#(11#,21#分別表示第一,二塊大膜的第一,二塊大膜的第一,二小塊….)。在每個皿放2mL含0.5%的脫脂奶粉(或含0.1%BSA)的TBST溶液,按編號按濃度(見記錄表)要求加入一抗,在搖床上先10-20分鐘,再將NC膜剪開按編號加入皿中,于室溫在搖床上雜交2小時。

      9 洗滌:

      用TBST洗滌NC膜4次,每次10分鐘

      10 上二抗:

      用試管將二抗(全部用羊抗兔IgG-HRP:因上述213,213-P,214,214-P均為由兔血生產的抗體)按1:5000(10μLIgG加TBST50mL)用含0.1%BSA的TBST溶液稀釋到50mL,每個皿放入5mL,放入NC膜(為節省IgG,可全部集中一個稍大的培養皿中,加20mL含0.1%BSA的TBST溶液)于室溫在搖床上雜交1小時。

      11 洗滌:

      用TBST洗滌NC膜4次,每次10分鐘

      12 準備顯色:

      準備好剪刀一把,鑷子一把,X膠片,適量顯影液,適量顯影液,適量定影液,TIP頭和相應的移液槍,暗盒,透明塑料片。

      上發光液: 將膜按編號順次排在硬塑料夾中,按1:1配制好ECL發光液各500μL,在暗房內將配好的發光液ECL1mL滴到NC膜上,并確保發光液均勻布在膜上,反應3-5分鐘。

      曝光:關照明燈,迅速取出合適膠片壓在NC膜隔一層薄膜上(注意位置),蓋緊暗盒,曝光1-10分鐘(視具體情況定)

      顯影:轉移到顯影液中,輕輕晃動使顯影均勻,直到能看見見黑色的條帶(約10-15秒)

      定影:迅速將X膠片過一次蒸餾水,然后轉移到定影液中,輕輕晃動定影液定影。

      沖洗:用自來水將經過定影處理的X膠片洗凈,晾干,記錄,保存實驗結果。

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