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      偶聯抗體的親和填料檢測步驟

      發布時間:2019-07-12 14:49:10 | 來源:

      1.清洗填料:取Anti-ACK-agarose100μL, 用1mL的PBSt洗(用移液槍將填料吹勻)3000轉/分離心去上清,重復3次,再用1mL 的PBS洗1次離心去上清。

      2.與抗原結合:加100μL的ACK-OV(1mg/mL),4度放置30min,用1mL 的PBST洗(用移液槍將填料吹勻)3000轉/分離心去上清,重復2次。

      3.洗脫抗原:加40μL0.1M HCl混勻,在室溫靜置5min,得抗原洗脫液,加入60μL0.1M Na2CO3中和,混勻,加入100μL0.05M Na2CO3,混勻,3000轉/分離心,取上清包被。

      4.稀釋上清液:取50μL的上清液稀釋于100μL0.05M Na2CO3,即上清液稀釋3倍,抗原洗脫液稀釋了15倍。

      5.包被:取一條酶標條,每孔先加入100μL0.05M Na2CO3,在第一孔加入100μL稀釋后的上清液,然后按2倍系列稀釋,依次得出抗原洗脫液稀釋度分別為1/30,1/60,1/120,1/240,1/480, 1/960, 1/1920,最后1孔設空白,37度靜置1h,

      6.用PBSt洗酶標條3次,每次拍凈。

      7.用1%的BSA37℃封閉30min;用PBSt洗酶標條3次,每次拍凈。

      8.ACK-HRP用0.1%的BSA+PBST+0.1%HRP穩定劑稀釋后,每孔加100μL,彈勻,37度反應30分鐘,PBST洗4次,每孔加100μLTMB顯色5-10分鐘,每孔加100μL,2M硫酸終止,在450nm讀數,滴度大于1/500為合格。

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