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      ELISA實驗步驟

      發布時間:2019-07-12 14:50:01 | 來源:

      第一天: 抗原固定(包埋)

      1. 抗原固定(包埋):將對應疫苗用0.05M的碳酸鈉(Na2CO3)溶液稀釋至2 微克/毫升, 在96孔ELISA薄板上每孔加100μL, 于37度2小時或4度冰箱過夜。第二天

      2. 封閉(BLOCKING):用PBSt沖洗薄板三次,每次必須把孔中液體拍掉. 再在每孔加1%脫指奶粉或BSA或0.1%吐溫(用PBSt稀釋)100μL,37度下放置30分鐘.

      3. 用PBSt沖洗薄板3次,拍干孔中液體。

      4. 滴度測試,每個樣本用8孔測試。

      (1)如樣本為血清,則每孔加上100μL含5μg/mL抑制疫苗(用0.1%BSA的PBSt液稀釋),抑制疫苗為偶聯物和要檢測抗體的疫苗的偶聯物一樣的另一種疫苗。

      (2)如樣本為已純化的抗體,則不用加抑制疫苗。

      5. (1)血清樣本用含5μg/mL抑制疫苗溶液(用0.1%BSA的PBSt液稀釋)稀釋400倍.在第一孔加100μL(總量為200μL/孔),混勻后移液100μL到第二孔,同樣混勻后從第二孔移液100μL到第三孔?????如此直至第7孔,留第八孔為空白對照。這樣從1-7孔的最終樣本稀釋度分別為:1:800,1:1600,1:3200, 1:6400, 1: 12800, 1: 25600, 1: 51200。(2)抗體樣本則稀釋1000倍,混勻后移液50μL到第二孔.....至第七孔,留第八孔為空白對照。

      6. 稀釋完后在37度反應60分鐘.

      7. 吸掉每孔中的液體,用PBSt分別清洗4次,每次拍干孔內液體.

      8. 上二抗:將抗兔IgG HRP用PBSt稀釋,稀釋倍數(1:5000-1:20000不等)由其濃度決定,每孔加100μL,37度反應30分鐘后重復清洗步奏4次。

      9. 拍干后每孔加入100μL的過氧化物酶(HRP)底物TMB生色. 37度大概15-30分鐘每孔加100μL2M硫酸終止反應,然后在酶聯測試儀于波長450納米讀數.

      10. 結果判斷、記錄:計算OD為50%時,血清(或抗體)的最大稀釋度,以最大稀釋度為樣品的滴度,記錄滴度,并將實驗結果報告相關人員。

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