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      抗原制備步驟

      發布時間:2019-07-12 14:50:46 | 來源:

      以每次制備5個疫苗(偶聯OV)為例:

      1. 稱取0.3g OV,溶解于5ml 0.1M Na2CO3。徹底溶解后于12000rpm離心2min,轉上清到潔凈的50mL離心管,加入1mL冷丙酮,冷卻到4度后備用。

      2. 稱取75 mg NHS-活化碘乙酸酯 (考慮雜質,用75mg) ,加入300μL的 DMF(富馬酸二甲脂),徹底溶解后于10000rpm離心1min,取上清備用,同時留沉淀備用。

      3. 邊渦旋邊逐滴將步驟2的上清液慢慢滴入步驟1的上清液(OV液),轉速不能過大,避免起氣泡。

      4. 在步驟2的沉淀中再次加入100μL的DMF,重懸后于10000rpm離心1min。取上清重復3一次。

      5. 將步驟4得到的OV-碘乙酸混合物(pH>9)放到4度,避光孵育15分鐘 (每隔5分鐘搖晃一次)。

      6. 離心后,OV-碘乙酸混合物(6 mL)過脫鹽柱(40 mL),方法為:將OV-碘乙酸混合物(大概6mL)均勻滴加到脫鹽柱表面,同時計量流出液空量。補加PBS維持液面。棄掉前面15mL空量體積,收集10mL濾液(OV大約25mg/mL),按2mL/管分裝備用?!咀⒁饷看尉璎F配現用】

      7. 按1 mL比5mg多肽比例,在5管多肽中各加入約1mL【0.1M Na2CO3+10mM EDTA】,混勻溶解。

      8. 將步驟7準備好的多肽,按每種多肽(5mg/mL)加入到步驟6分裝好的2mL脫鹽OV-碘乙酸混合物,混勻。【測PH,PH必須大于7;注意步驟7和8要一管一管的做?!?

      9. 搖床上低速搖動1小時后,加入4倍體積(12mL)的冰凍丙酮,4度沉淀蛋白質30分鐘。

      10. 6000rpm離心10分鐘,去上清(另外保留,備ELISA檢測用),沉淀加入50mL蒸餾水,將抗原稀釋成1mg/mL(沉淀部份也是疫苗)。分裝凍存備用(制備注射前注意把沉淀也包含在內)。

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